《Nature:CRISPR–Cas系統,基因組改造新技術》

Nature:CRISPR–Cas系統,基因組改造新技術


有一種細菌編碼的酶能夠利用向導RNA(guide RNA)分子對特定的DN**段進行定向切割,科學家們利用這種特點開發出了一種能夠對基因組進行特異性定點改造的工具,對細胞乃至整個生物體進行基因組改造。目前已經利用這種技術對細菌、人體細胞以及斑馬魚進行過成功的遺傳學改造工作。

日本大阪大學(Osaka University)的科研人員們曾經在1987年發表過一篇論文,不過這篇論文在當時并沒有引起太多人的注意,只不過是一篇普普通通的小文章。這幫大阪大學的科學家當時正在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因進行研究,不過他們在工作中發現,在這個基因編碼區域的附近存在一小段不同尋常的DN**段,這些片段是由簡單的重復序列組成的,而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。關于這樣一個重復序列他們當時在論文中是這樣評價的——“我們目前也不太清楚這些序列的生物學意義。”不過這個在差不多三十年之前取得的不起眼的“小發現”在今天卻綻放出了耀眼的光芒,因為如今科學家們正是利用這個小片段找到了一種可以對多種生物的基因組進行遺傳改造的工具,而且這種方法操作起來還非常地簡單。就在短短的一個月之內,在包括《科學》(Science)和《自然 生物技術》(Nature Biotechnology)等雜志上就已經發表了5篇相關的論文介紹這個現在被稱作CRISPR–Cas系統(CRISPR–Cas systems)、簡便而又實用的基因組改造新技術。

近幾十年來,隨著全基因組測序技術的不斷成熟,我們在各種細菌和古細菌(archaea)中也陸續發現了很多成簇的、規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences,即CRISPR序列,這就是二十多年前日本科學家發現的那個序列)和CRISPR相關基因(CRISPR-associated genes, Cas gene)。研究發現,這些CRISPR序列與很多病毒或者質粒的DNA序列是互補的,說明這套CRISPR–Cas系統很有可能是生物體抵御病毒等外來入侵者的一套特異性防御機制,就好像是另外一套適應性免疫反應系統(adaptive immune system)。后續的遺傳學試驗和生物化學試驗也證實了這種猜測。

雖然有很多CRISPR–Cas系統需要多種蛋白的參與,但是在很多細菌的胞內都只需要一種內切酶(endonuclease)——Cas9就足夠了,我們將這種CRISPR–Cas系統也稱作2型系統(type II systems),如圖1所示。Cas9內切酶在向導RNA的指引下能夠對各種入侵的外源DNA分子進行定點切割,不過主要識別的還是保守的間隔相鄰基序(proto-spacer adjacent motifs,PAM基序)。如果要形成一個有功能的DNA切割復合體,還需要另外兩個RNA分子的幫助,它們就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA)。不過最近有研究發現,這兩種RNA可以被“改裝”成一個向導RNA(single-guide RNA, sgRNA)。這個sgRNA足以幫助Cas9內切酶對DNA進行定點切割。**的報道稱,在多種類型的細胞和生物體內,這種RNA介導的Cas9酶切作用能夠正常地行使功能,在完整基因組上的特定位點完成切割反應。這樣就可以方便地進行后續的基因組改造工作了。細胞通常會通過兩種方式對發生雙鏈斷裂的DNA進行修復,這兩種方式分別是同源重組修復機制(homologous recombination, HR)和非同源末端連接修復機制(non-homologous end joining, NHEJ),不過在修復的過程中細胞有可能會對修復位點進行修飾,或者插入新的遺傳信息。


圖1 RNA介導的Cas9系統定向基因組修飾作用機制示意圖。Cas9內切酶是一種DNA內切酶,很多細菌都可以表達這種蛋白,Cas9內切酶能夠為細菌提供一種防御機制,避免病毒或者質粒等外源DNA的侵入。Cas9內切酶必須在向導RNA分子的引導下對DNA進行切割,這是因為這些向導RNA分子含有與靶DNA序列互補的序列,我們稱之為PAM序列。Cas9內切酶在向導RNA分子的引導下對特定位點的DNA進行切割,形成雙鏈DNA缺口,然后細胞會借助同源重組機制(homologous recombination)或者非同源末端連接機制(non-homologous end joining)對斷裂的DNA進行修復。如果細胞通過同源重組機制進行修復,會用另外一段DN**段填補斷裂的DNA缺口,因而會引入一段“新的”遺傳信息。最近有多項研究都表明,RNA介導的Cas9系統可以被用于對人類和小鼠細胞,以及細菌或斑馬魚胚胎進行基因組改造的工作當中。

Cong、Mali和Cho這三個課題組開展的多項研究都表明這種RNA介導的Cas9系統在人類細胞當中同樣能夠正常的發揮作用。研究發現,對化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)編碼的Cas9內切酶進行改造之后也可以讓它們在人類細胞的細胞核中被活化,然后再搭配針對人體DNA序列設計的大約20bp長的雙RNA復合體或者sgRNA,就可以對人體基因組進行定點切割和改造。科研人員們在多種人體細胞(其中還包括了誘導多能干細胞)內共表達了這種專用于人體的Cas9內切酶和向導RNA,結果都在預定的DNA位點觀察到了基因組雙鏈DNA切割,以及后續的修復現象,成功率高達38%,而且還發現這種Cas9內切酶對細胞幾乎沒有毒性。這套Cas9系統還能夠在人體細胞內以非常高的效率對普通的基因組位點進行定向基因替換(targeted gene replacement)的操作。在Jinek等人于同期發表的另外一篇論文中,他們發現這套RNA介導的Cas9系統還能夠在人體細胞內誘發位點特異性的基因組修飾動作(site-specific genome modifications),而且他們還發現Cas9蛋白與向導RNA結合、組裝的動作是這套位點特異性的基因組修飾過程里的限速步驟。

之前的研究發現,細胞更傾向于使用同源重組機制對單鏈DNA損傷(single-stranded DNA breaks)進行修復,因此引入的突變也會更少,Mali和Cong等人也對各種不同的、只能夠形成單鏈DNA斷裂的Cas9內切酶進行了試驗。結果發現這些突變的Cas9內切酶在細胞內引發NHEJ修復的機率的確更低,但是它們在引發基因替換(這主要是借助同源重組修復機制)的效率方面與野生型的Cas9內切酶不相上下。Mali和Cong這兩個課題組還發現這套Cas9系統具有多重靶向功能(multiplexed targeting),這些Cas9內切酶能夠與基因組中兩個不同的序列(位點)結合,形成多處斷裂。此外,Cong等人還發現如果分別表達tracrRNA和crRNA,還可以進一步提高切割的效率。這一發現表明,如果進一步改進sgRNA的設計方案,使其更接近雙RNA復合體的結構,將會進一步提高Cas9系統的基因組編輯效率。

除了這些細胞學的研究成果之外,科學家們還發現這套Cas9系統對于生物體同樣有效,一樣可以對生物體進行基因組改造的操作。Jiang等人發現,在細菌內表達多種向導RNA之后,Cas9內切酶可以對細菌基因組的多個位點進行修飾操作。借助這一技術可以對各種微生物進行遺傳學改造,打造出符合我們人類需要的工程微生物,使其造福人類,在生物能源或者生物制藥等諸多領域具有極大的應用潛力。Hwang等人則使用單細胞斑馬魚胚胎(one-cell-stage embryos)進行了試驗,他們將編碼Cas9蛋白的mRNA和特定的向導RNA(與斑馬魚基因組DNA的匹配機率高達24~59%)注射到斑馬魚胚胎內,結果取得了成功,在所有被注射的斑馬魚胚胎內,10個切割位點中有8個位點都發生了切割,并且引入了插入或者缺失突變。這一試驗結果表明,RNA介導的Cas9切割活性完全可以應用于生物體水平,哺乳動物和植物都可以使用這種技術進行遺傳學改造。目前最有價值的應用應該就是使用這種技術為各種人類疾病構建出動物模型。

這種基因組改造技術還可以被應用于合成生物學(synthetic biology)、基因定向干擾或者多重基因干擾(即基因網絡干擾)和基因治療等領域。接下來的研究難點應該就是如何克服脫靶效應(off-target effect),如何提高基因組改造的效率和特異性,以及如何將這項技術應用于更多的物種等方面。所以我們也需要對這種Cas9平臺與其它的基因組改造技術,比如巨核酶技術(meganucleases)、鋅指核酶技術(zinc-finger nucleases)以及TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技術等進行深入和全面的對比。除了在基因組改造方面的應用之外,使用Cas9平臺還可以進行基因沉默等方面的操作(比如使Cas9蛋白失活),或者賦予Cas9蛋白更多新的功能(比如使其具有轉錄因子樣的轉錄活性等)。其實除了這種Cas9系統之外,細菌還為我們貢獻了很多其它的工具,比如限制性內切酶(restriction enzymes)、熱穩定的聚合酶(thermostable polymerase)等,極大促進了分子生物學的發展。下面,讓我們一起期待Cas9技術在生物技術和醫學等諸多生物學領域里創造出更多的奇跡吧。



  • 電話咨詢
  • 0571-85888907
东成西就ⅲ必中8码开奖